Исследование регуляции транскрипции ВИЧ-1 белком человека Ku и поиск клеточных факторов, участвующих в Ku-опосредованной регуляции транскрипции, с использованием методов секвенирования РНК нового поколения

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 17-14-01107

НазваниеИсследование регуляции транскрипции ВИЧ-1 белком человека Ku и поиск клеточных факторов, участвующих в Ku-опосредованной регуляции транскрипции, с использованием методов секвенирования РНК нового поколения

Руководитель Готтих Марина Борисовна, Доктор химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова» , г Москва

Конкурс №18 - Конкурс 2017 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология

Ключевые слова гетеродимерный белок Ku70/Ku80, вирус иммунодефицита человека, активация транскрипции, латентность, CRISPR-Cas9, нокаут, РНК-секвенирование нового поколения

Код ГРНТИ34.15.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Существующая в настоящий момент антиретровирусная терапия (АРТ) достаточно эффективно позволяет продлевать жизнь и улучшать качество жизни ВИЧ-инфицированных людей. Однако она не позволяет полностью удалить вирус из организма человека. Причиной этого является наличие семейств клеток, содержащих интегрированный провирус в транскрипционно-неактивном состоянии, на который не действуют компоненты АРТ. Исследование молекулярных механизмов поддержания вируса в неактивном латентном состоянии и механизмов выхода из него важно с точки зрения создания новых подходов к терапии ВИЧ, которые позволили бы полностью удалить вирус из организма. Латентная стадия вирусной инфекции характеризуется отсутствием полноценной транскрипции с вирусного промотора. Однако в определенных условиях транскрипция может активироваться, что при отсутствии терапии вызывает развитие СПИДа. Изучение клеточных белков, участвующих в активации транскрипции с промотора ВИЧ-1 при переходе вируса из латентной фазы в активную, крайне актуально, поскольку в перспективе поможет понять механизм этого процесса и найти подходы к его регуляции. Одним из клеточных белков, изменение уровня которого в клетке влияет на эффективность транскрипции с промотора ВИЧ-1, является гетеродимерный белок Ku. В ядре клетки белок Ku колокализуется c сайтами элонгации транскрипции РНК полимеразы II и взаимодействует с ее элонгационной формой. Показано также, что Ku-ассоциированная киназа DNA-PK может in vitro фосфорилировать РНК полимеразу II. Однако достоверный механизм воздействия гетеродимера Ku на транскрипцию с интегрированного провируса и возможность участия этого белка в активации транскрипции при переходе из латентной в активную фазу инфекции не известен. Исследование этого механизма позволит предложить новые стратегии лечения ВИЧ-инфекции, которые, возможно, помогут полностью ликвидировать вирус в организме больного. Гетеродимер Ku, состоящий из субъединиц Ku70 и Ku80, является многофукциональным клеточным белком. Достаточно детально изучено его участие в репарации двуцепочечных разрывов в ДНК путем негомологичного соединения концов (NHEJ), где Ku выступает в качестве ДНК-связывающего компонента ДНК-зависимой протеин-киназы (DNA-PK). Тем не менее, учитывая, что Ku участвует во многих клеточных процессах, можно предположить, что его участие в транскрипции ВИЧ-1 является опосредованным и связано с эффектами, которые Ku имеет на транскрипцию клеточных генов, или осуществляется через взаимодействие Ku с транскрипционными факторами. Возможно, что имеет место совокупность этих условий. Необходимо также учитывать, что белок Ku является гетеродимером, и возможно, что каждая из его субъединиц может оказывать свое действие на транскрипцию. Тем не менее, в большинстве работ вывод о влиянии всего гетеродимера Ku на транскрипцию делается на основании данных по нокдауну/нокауту только одной из его субъединиц. Вместе с тем, появляется все больше данных о том, что отдельные субъединицы белка Ku имеют свои собственные функции в клетке, и нокаут одной из них не подавляет полностью функционирование другой. В настоящем проекте впервые будет проведено систематическое исследование влияния каждой из субъединиц Ku на уровень транскрипции с промотора ВИЧ-1 в репортерной системе и в клетках линии J-Lat, содержащих латентно-интегрированный провирус. Помимо этого, впервые будет исследовано изменение клеточного транскриптома в ответ на изменение внутриклеточной концентрации отдельных субъединиц Ku и каталитической субъединицы DNA-PK путем нокаутирования их генов и последующего глубокого секвенирования РНК. В результате этой работы мы планируем отобрать ряд клеточных белков, эффективность транскрипции которых зависит от уровня Ku70 и/или Ku80, и которые, вместе с тем, могут участвовать в транскрипции провируса. Таким образом, в результате проведенной работы мы впервые сможем точно ответить на вопрос, каково влияние каждой из субъединиц Ku на транскрипцию с промотора ВИЧ-1, и выяснить механизм этого влияния (прямой или опосредованный). Мы также сможем выяснить, может ли изменение уровня экспрессии каждой из субъединиц Ku вызвать активацию транскрипции латентно-интегрированного провируса, т.е. в системе, имитирующей выход вируса из латентной фазы. Необходимо также отметить, DNA-PK в целом и Ku в частности участвуют в большом количестве клеточных процессов, поэтому наше исследование изменений клеточного транскриптома в ответ на изменение внутриклеточной концентрации отдельных субъединиц DNA-PK имеет самостоятельную значимость, поскольку позволит получить дополнительную информацию о функциональной роли этого мультибелкового комплекса.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Шадрина О.А., Княжанская Е.С., Готтих М.Б. TAR RNA-dependent mechanism of Ku-mediated transcription regulation of HIV-1 genes FEBS Open Bio, V.8 (Suppl.S1) P.201 (год публикации - 2018)
10.1002/2211-5463.12453

2. Анисенко А.Н., Княжанская Е.С., Зацепин Т.С., Готтих М.Б. The interaction between HIV-1 integrase and Ku70 facilitates postintegrational DNA repair FEBS Open Bio, V. 8 (Suppl. S1) PP. 202-203 (год публикации - 2018)
10.1002/2211-5463.12453

3. Анисенко А.Н., Княжанская Е.С., Исагулянц М.Г., Готтих М.Б. A qPCR assay for measuring the post-integrational DNA repair in HIV-1 replication Journal of Virological Methods, V.262, PP. 12-19 (год публикации - 2018)
10.1016/j.jviromet.2018.09.004

4. Готтих М.Б.,Анисенко А.Н., Княжанская Е.С., Мазуров Д.В. The HIV-1 integrase interaction with Ku70 in postintegrational gap repair Retrovirology, V. 15 (Suppl. 1):55, P. 17 (год публикации - 2018)
10.1186/s12977-018-0436-z

5. Княжанская Е.С,Анисенко А.Н, Шадрина О.А, Калинина А.,Зацепин Т.С., Залевский А.,Мазуров Д.В., Готтих М.Б. NHEJ pathway is involved in post‑integrational DNA repair due to Ku70 binding to HIV‑1 integrase Retrovirology, 16, Article number: 30 (год публикации - 2019)
10.1186/s12977-019-0492-z

6. Анисенко А.Н., Готтих М.Б. Role of Cellular DNA Repair Systems in HIV-1 Replication Molecular Biology, Vol. 53, No. 3, pp. 313–322. (год публикации - 2019)
10.1134/S0026893319030026

7. Шадрина О.А., Анисенко А.Н., Готтих М.Б. The role of components of the DNA-repair complex DNA-PK in transcription regulation FEBS Open Bio, 9 (Suppl. 1) 156 (год публикации - 2019)
10.1002/2211-5463.12675

8. М.Б. Готтих, А.Н. Анисенко, Е.С. Княжанская Репарация повреждений клеточного генома, возникающих при интеграции ДНК ВИЧ-1 Acta Naturae, Спецвыпуск Том 2, стр. 7 (год публикации - 2019)

9. Зотова А., Пичугин А., Атемасова А., Княжанская Е.С., Лопатухина Е., Митькин Н.А., Холмухамедов Э.Л., Готтих М.Б., Купраш Д., Филатов А., Мазуров Д.В. Isolation of gene-edited cells via knock-in of short glycophosphatidylinositol-anchored epitope tags Scientific Reports, 9:3132, p.1-10 (год публикации - 2019)
10.1038/s41598-019-40219-z

10. М.Б. Готтих, А.Н. Анисенко, Е.С. Княжанская, С.П. Королев, О.А. Шадрина Роль клеточного белка Ku в репликации ВИЧ-1 Acta Naturae, Спецвыпуск, с.47 (год публикации - 2017)

11. Е. Княжанская, А. Анисенко, М. Готтих The differential role of Ku in the HIV-1 replication: influence on integration and transcription FEBS Journal, 284 (Suppl. 1), 139-140 (год публикации - 2017)
10.1111/febs.14174

Публикации