Создание высокочувствительных тест-систем для одновременной экспресс-диагностики широкого спектра болезней картофеля на основе qPCR-матриц длительного хранения с возможностью быстрой оптимизации архитектуры матрицы в соответствии с запросами регионального потребителя

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 16-16-04109

НазваниеСоздание высокочувствительных тест-систем для одновременной экспресс-диагностики широкого спектра болезней картофеля на основе qPCR-матриц длительного хранения с возможностью быстрой оптимизации архитектуры матрицы в соответствии с запросами регионального потребителя

Руководитель Приданников Михаил Викторович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Всероссийский научно-исследовательский институт фитопатологии" , Московская обл

Конкурс №16 - Конкурс 2016 года на получение грантов по приоритетному направлению деятельности РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (исследования в области картофелеводства и птицеводства)

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-104 - Агробиотехнологии

Ключевые слова ПЦР в реальном времени, qPCR матрица, мультиплексный анализ, диагностика болезней картофеля, вирусы и вироиды картофеля, фитоплазма, картофельные нематоды, Phytophthora infestans, Alternaria sp., Dickeya solani, Ralstonia solanacearum, Erwinia sp., Clavibacter sp., Pectobacterium sp., Rhizoctonia solani

Код ГРНТИ68.37.31

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Растущая глобализация и увеличивающиеся объемы международной торговли семенным материалом и сельскохозяйственной продукцией, климатические изменения, приводящие к расширению ареалов фитопатогенов и вредителей, а также появление патогенов, устойчивых к действию современных пестицидов, значительно увеличили потребность сельскохозяйственного сектора производства в средствах быстрой, точной и надежной диагностики болезней растений. В настоящее время в фитодиагностике выделяются две основные группы диагностических методов – иммуноферментный анализ (ИФА) и ПЦР. Будучи относительно простыми и дешевыми, ИФА-методы получили широкое распространение, однако в ряде случаев оказываются недостаточно чувствительны и специфичны, а возможность проведения мультиплексной диагностики в этом случае весьма ограничена. Традиционные ПЦР-методы высокочувствительны и специфичны, однако время- и трудоемки и чувствительны к условиям проведения анализа, что ограничивает возможности анализа в полевых лабораториях и требует привлечения высококвалифицированного персонала; кроме того существуют проблемы и с мультиплексной диагностикой более чем 2-3 патогенов. Современные модификации ПЦР-методов в той или иной мере преодолевают вышеупомянутые недостатки, однако идеальное решение в этом направлении пока так и не достигнуто, особенно в части, касающейся одновременной диагностики широкого спектра патогенов. Предлагаемые в настоящее время на мировом рынке лабораторные тесты и коммерческие тест-системы основываются на принципе «один патоген – один тест». Предлагаемый нами вариант решения вышеупомянутой задача – разработка гибкой диагностической тест-системы на основе уникальных qPCR-матриц длительного хранения, обеспечивающей возможность проведения одновременной диагностики широкого спектра болезней картофеля (бактериальных, грибных, вирусных, вироидных, фитоплазменных и нематодных) и отличающейся быстротой, высокой чувствительностью, мобильностью и простотой в эксплуатации, а также возможностью быстрой оптимизации архитектуры матриц в соответствии с запросами регионального потребителя - является уникальным и не пока не имеющим мировых аналогов. Предлагаемая технология обладает следующими достоинствами: (1) Высокая производительность (возможность проведения одновременного анализа до 8-10 патогенов), (2) Сниженный расход реагентов за счет малого объема микрореактора (1 мкл), (3) Сокращение времени проведения анализа до 1-1.5 ч с учетом пробоподготовки, (4) Высокая специфичность и чувствительность (до нескольких копий ДНК/РНК на пробу), (5) Простота и нетребовательность к квалификации оператора, связанные с технологией производства матриц-пресервов, автоматизацией основных этапов анализа и портативностью оборудования, (6) Гибкая архитектура матрицы, обеспечивающая возможность дизайна тест-систем в соответствии с нуждами конкретных потребителей. Отдельно следует выделить ключевое ноу-хау технологии, позволяющее хранить подготовленные матрицы (пресервы) до полугода при комнатной температуре без потери качества анализа. Данное преимущество является уникальным и не имеющим аналогов в мире и значительно упрощает хранение, транспортировку и применение матриц. В рамках предлагаемого проекта с учетом уже имеющегося задела предлагается разработка qPCR-матриц для диагностики широкого спектра болезней картофеля. Будут созданы матрицы для выявления возбудителей вирусных и вироидных (PLRV, PMTV, PVХ, PVA, PVM, PVY, PVYn, PVS, PSTV), грибных и оомицетных (Phytophthora infestans, Alternaria solani, A. alternatа, Synchytrium endobioticum, Rhizoctonia solani, Fusarim sp.), бактериальных (Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus, Pectobacterium atrosepticum, Dickeya sp., Erwinia carotovora subsp. atroseptica, Ralstonia solanaceaum), фитоплазменных (Candidatus liberibacter, 16 Sr I, 16 Sr III, 16 Sr VI) и нематодных (Globodera rostоchiensis, Meloidogyne hapla, Ditylenchus destructor, и внешние карантинные объекты G. pallida, M. chitwoodi, M. fallax, M. enterolobii) болезней картофеля. На основании данных фитосанитарного мониторинга посадок картофеля в различных регионах РФ будет проведено картирование распространенности и вредоносности экономически значимых болезней картофеля, с учетом которого будут предложены различные варианты компоновки разрабатываемых тест-систем для различных регионов РФ. Новизна и актуальность предлагаемого проекта Впервые будут разработаны и доведены до уровня коммерческого производства диагностические тест-системы на основе qPCR-матриц длительного хранения, позволяющие одновременное выявление до 8-10 патогенов с сохранением высокой чувствительности и специфичности. Помимо основного набора фитопатогенных микроорганизмов, присутствующего в коммерческих диагностических наборах, представленных в настоящее время на российском и мировом рынках, в состав разрабатываемых тест-систем будет впервые включен ряд фитопатогенов (Dickeya solani, некротическая форма вируса PVY, четыре вида фитоплазм), экономическая значимость которых в России в последние годы существенно возросла. Таким образом, в результате выполнения проекта будут получены новые биоинформационные данные, которые позволят подобрать эффективные праймеры для возбудителей болезней картофеля, отсутствующих в коммерческих диагностических наборах и будет оценено генотипическое разнообразие региональных популяций некоторых фитопатогенов. Предполагаемое в рамках проекта картирование распространенности и экономической значимости включенных в исследование фитопатогенов картофеля позволит получить данные не только по широко известным болезням, включенным в систему фитосанитарного мониторинга, но и в отношении патогенов, ранее считавшихся незначимыми но, вследствие изменения климата, приобретшими в последние годы заметное влияние на данную сельскохозяйственную культуру. С учетом данных картирования будет осуществлена локализация разработанных тест-систем для различных регионов, максимально отвечающая их потребностям в диагностике. Актуальность и востребованность разрабатываемых диагностических тест-систем подтверждается интересом со стороны Россельхознадзора и Россельхозцентра. В 2014-2015 гг. на базе 13 отделений Россельхозцентра были успешно проведены лабораторно-полевые испытания уже разработанных тест-систем для нескольких вирусных заболеваний картофеля. В 2016 и последующих годах Россельхозцентр планирует расширение сотрудничества (закуплено необходимое оборудование и планируется проведение испытаний тест-систем уже в 16 областях РФ) и заинтересован в приобретении разрабатываемых матриц-пресервов (см. приложение). Присутствует также интерес к разработке со стороны зарубежных компаний, что показывает потенциальную востребованность технологии не только внутри страны, но и на мировом уровне.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Никитин М.М., Стацюк Н.В., Французов П.А., Джавахия В.Г., Голиков А.Г. MATRIX APPROACH TO SIMULTANEOUS DETECTION OF MULTIPLE POTATO PATHOGENS AND ITS PRACTICAL APPLICATION Abstract Book, XV EUROPEAN SOCIETY FOR AGRONOMY CONGRESS "INNOVATIVE CROPPING AND FARMING SYSTEMS FOR HIGH QUALITY FOOD PRODUCTION SYSTEMS" (Geneva, August 27-31, 2018), c. 17 (год публикации - 2018)

2. Никитин М.М., Стацюк Н.В., Французов П.А., Джавахия В.Г., Голиков А.Г. MATRIX APPROACH TO THE SIMULTANEOUS DETECTION OF MULTIPLE POTATO PATHOGENS BY REAL-TIME PCR Journal of Applied Microbiology, V. 124, No. 3, pp. 797-809 (год публикации - 2018)
10.1111/jam.13686

3. Французов П.А., Никитин М.М., Малько А.М., Живых А.В., Стацюк Н.В., Джавахия В.Г., Голиков А.Г. ШИРОКОМАСШТАБНЫЙ СКРИНИНГ РНК- И ДНК-СОДЕРЖАЩИХ ПАТОГЕНОВ КАРТОФЕЛЯ ПРИ ПОМОЩИ ПЦР В МАТРИЧНОМ ФОРМАТЕ Достижения науки и техники АПК, Т. 32, № 3, С. 45-49. (год публикации - 2018)
10.24411/0235-2451-2018-10309

4. Дейч К.О., Приданников М.В., Никитин М.М., Голиков А.Г. Disposable qPCR matrices for molecular diagnostics of plant-parasitic nematodes on potato 33th Symposium of the European Society of Nematologists (Ghent, 9 – 13th September 2018). Abstract book, p. 101 (год публикации - 2018)

5. Никитин М.М., Стацюк Н.В., Джавахия В.Г., Голиков А.Г. РАЗРАБОТКА ТЕСТ-СИСТЕМ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ ПАТОГЕНОВ КАРТОФЕЛЯ МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ В МИКРОМАТРИЧНОМ ФОРМАТЕ Международная научно-практическая конференция "СОВРЕМЕННЫЕ ПРОБЛЕМЫ И ДОСТИЖЕНИЯ В ЗАЩИТЕ КАРТОФЕЛЯ ОТ БОЛЕЗНЕЙ, ВРЕДИТЕЛЕЙ И СОРНЯКОВ" (Большие Вязёмы, Московская область 12-14 марта 2018 г.) Программа и тезисы докладов, с. 19-20 (год публикации - 2018)

6. Дейч К.O., Приданников М.В., Никитин М.М., Стацюк Н.В., Джавахия В.Г., Голиков А.Г. Simultaneous detection of three plant-parasitic nematode species from the genus Ditylenchus using a real-time qPCR matrix-based technology Russian Journal of Nematology, v. 26, no. 2, p. 97–107 (год публикации - 2018)

7. Никитин М.М., Стацюк Н.В., Французов П.А., Джавахия В.Г., Приданников М.В., Голиков А.Г. ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНЫЕ QPCR-МАТРИЦЫ: ПЕРСПЕКТИВНЫЙ ПОДХОД ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ШИРОКОГО СПЕКТРА БОЛЕЗНЕЙ РАСТЕНИЙ В УСЛОВИЯХ ПОЛЕВЫХ ЛАБОРАТОРИЙ Сборник материалов конференции "Современные подходы и методы в защите растений", с. 84-86 (год публикации - 2018)

8. Дейч К.О., Никитин М.М., Стацюк Н.В., Джавахия В.Г., Голиков А.Г. РАЗРАБОТКА ВЫСОКОЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ РАКА КАРТОФЕЛЯ (SYNCHYTRIUM ENDOBIOTICUM) МЕТОДОМ ПЦР В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ Сборник материалов конференции "Современные подходы и методы в защите растений", c.78-79 (год публикации - 2018)

9. Никитин М.М., Дейч К.О., Гревцева И., Гирсова Н., Кузнецова М., Приданников М., Джавахия В., Стацюк Н., Голиков А. Preserved Microarrays for Simultaneous Detection and Identification of Six Fungal Potato Pathogens with the Use of Real-Time PCR in Matrix Format Biosensors, vol 8, issue 4, Article ID 129 (год публикации - 2018)
10.3390/bios8040129

10. Никитин М., Дейч К., Стацюк Н., Джавахия В., Голиков А. Development of a Real-Time Assay for Detection of Synchytrium endobioticum, a Quarantine Pathogen of Potato AIP Conference Proceedings (год публикации - 2019)

11. Приданников М.В. Integration of fundamental nematology science with applied researches: the relationship of academic science and applied plant protection Russian Journal of Nematology, 2(27):154-155 (год публикации - 2019)

12. Никитин М.М., Стацюк Н.В., Французов П.А., Джавахия В.Г., Голиков А.Г. Разработка высокочувствительных тест-систем для одновременной экспресс-диагностики широкого спектра болезней картофеля на основе qPCR-матриц длительного хранения Тезисы докладов Х международной научной конференции "Микробные технологии: фундаментальные и прикладные аспекты", с. 172-173 (год публикации - 2017)

13. Никитин М.М., Стацюк Н.В., Французов П.А., Приданников М.В., Голиков А.Г. Rapid and simple detection of two potato cyst nematode species by real-time multiplex PCR using preserved microarray-based test systems Russian Journal of Nematology, т. 25(1), с. 51–60 (год публикации - 2017)

14. Приданников М.В., Стацюк Н.В., Никитин М.М., Французов П.А. Use of a microchip-based qPCR for molecular diagnostics of potato cyst nematodes Abstracts of the 12th International Symposium of the Russian Society of Nematologists “Nematodes and other Ecdysozoa under the growing ecological footprint on ecosystems”, c. 76 (год публикации - 2017)

15. Малько А.M., Живых А.В., Никитин М.М., Французов П.А., Стацюк Н.В., Джавахия В.Г., Голиков А.Г. Мониторинг вирусных инфекций картофеля с использованием матричной ПЦР-диагностики Картофель и овощи, № 12, с. 26-29 (год публикации - 2017)

16. Никитин М.М., Дейч К.О., Павлова Е.А., Иванов А.В., Стацюк Н.В., Джавахия В.Г., Голиков А.Г. Выявление и идентификация возбудителя порошистой парши картофеля Spongospora subterranea методом ПЦР в реальном времени Защита и карантин растений (год публикации - 2018)

Публикации