Применение наночастиц для создания новой технологии редактирования генома картофеля

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 16-16-04019

НазваниеПрименение наночастиц для создания новой технологии редактирования генома картофеля

Руководитель Тальянский Михаил Эммануилович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регион Общество с ограниченной ответственностью "Дока-Генные Технологии" , Московская обл

Конкурс №16 - Конкурс 2016 года на получение грантов по приоритетному направлению деятельности РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по поручениям (указаниям) Президента Российской Федерации» (исследования в области картофелеводства и птицеводства)

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки; 06-106 - Растениеводство

Ключевые слова Редактирование генома, наночастицы, CRISPR/Cas9, селекция картофеля, устойчивость к вирусам, Y-вирус картофеля, коилин, устойчивость к солевому стрессу, ген вакуолярной инвертазы.

Код ГРНТИ62.37.29

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Рост населения Земли (согласно прогнозам к 2050 г. население Земного шара может достигнуть 9 млрд. человек), ограниченное количество полезных пахотных земель и изменения климата ставят под угрозу глобальную продовольственную безопасность. Для успешного преодоления этих вызовов необходима разработка инновационных технологий в области селекции сельскохозяйственных растений с заданными хозяйственно-ценными признаками. Одной из таких технологий является редактирование генома при помощи нуклеаз, специфичных к целевой последовательности ДНК, которое представляет собой альтернативу классической генной инженерии. Новейшая и наиболее передовая технология геномного редактирования основана на использовании кластеризованных регулярно перемежающихся коротких палиндромных повторов (CRISPR) и ассоциированных с ними белков (Cas-белков), относящихся к системе адаптивного иммунитета прокариот. Системы CRISPR/Cas защищают бактерии и археи от чужеродных нуклеиновых кислот, например, вирусных, путем специфичного расщепления экзогенной ДНК. Возможность репрограммирования специфичности CRISPR/Cas эндонуклеаз при помощи малых некодирующих РНК открыла принципиально новое направление для создания высокоточных и надежных способов редактирования генома. Наиболее широко используется система, основанная на нуклеазе Cas9 из Streptococcus pyrogenes и единой искусственно синтезированной гидовой РНК (single guide RNA, sgRNA), определяющей целевую нуклеотидную последовательность редактируемой ДНК, в обе цепи которой нуклеаза вносит разрыв. В большинстве случаев репарация двухцепочечного разрыва происходит по механизму негомологичного соединения концов (non-homologous end joining, NHEJ): два конца разорванной ДНК соединяются, приводя к образованию вставок или делеций одного или нескольких нуклеотидов. Это может привести к нарушению рамки считывания в целевом гене и, следовательно, инактивации или выключению (нокауту) гена. С другой стороны, если в систему добавляется фрагмент ДНК, обладающий высокой степенью гомологии с разорванной цепью ДНК, то этот новый сегмент может быть встроен вместо исходной ДНК при помощи механизма гомологичной рекомбинации (homologous recombination, HR). Это, в свою очередь, может привести к появлению гена, кодирующего белок с модифицированной функцией или новыми свойствами в результате «точечной замены нуклеотидов» или «замены гена». Поскольку для обеспечения специфичности действия нуклеазы требуется только одна sgRNA, использование системы CRISPR/Cas9 отличается простотой, эффективностью и универсальностью, что выгодно отличает ее от систем редактирования генома ZNF и TALEN. Данная технология уже привела к крупным прорывам во всех областях наук о жизни, включая биотехнологию и медицину, и в настоящее время становится все более популярной в растительной биологии. Вместе с тем существующие методы направленной доставки системы CRISPR/Cas9 в клетки растений с использованием агробактерий ограничивают возможности применения этой технологии в растениеводстве, поскольку относятся к технологиям генетической модификации организмов (ГМО). Для преодоления данного недостатка и полной реализации потенциала технологии редактирования генома как эффективного и надежного инструмента селекции растений предлагаемый проект предусматривает разработку нового способа прямой доставки рекомбинантного белка Cas9 (или кодирующей его мРНК) и sgRNA в клетки растений картофеля, в качестве конкурентоспособной альтернативы используемым технологиям доставки с помощью плазмид (агробактерий). Основной целью предлагаемого междисциплинарного проекта является создание новой эффективной технологии на основе наночастиц (НЧ) для прямой доставки компонентов системы CRISPR/Cas9 в клетки растений картофеля для редактирования генома картофеля. Планируется выполнить следующие задачи: 1. Оценка различных типов НЧ для доставки белков и РНК в ткани картофеля и выбор наиболее перспективных вариантов для создания наноплатформ-носителей компонентов системы CRISPR/Cas9. 2. Выбор/оптимизация способов доставки (введения) НЧ, предназначенных для переноса белка/РНК, в ткани картофеля. 3. Сборка системы CRISPR/Cas9 и проверка ее активности на генах (ДНК) картофеля в условиях in vitro. 4. Разработка платформы доставки CRISPR/Cas9 на основе НЧ для нокаута (модельных и целевых) генов в растениях картофеля. 5. Разработка платформы CRISPR/Cas9 на основе НЧ для замены генов в растениях картофеля. 6. Рекомендации по реализации стратегий селекции картофеля на основе применении новой платформы для редактирования генома, разработанной в ходе выполнения проекта. Общая стратегия проекта состоит в дизайне наиболее подходящих НЧ и разработке способов эффективной прямой доставки компонентов системы CRISPR/Cas9 в клетки картофеля с последующей демонстрацией возможностей применения новой технологии геномного редактирования для нокаута генов, точечных нуклеотидных замен или замен отдельных генов с использованием как модельных генов (таких как ген фитоен-десатуразы, PDS, и ген зеленого флуоресцентного белка, GFP), так и генов, отвечающих за ценные хозяйственные качества/признаки растений картофеля (например, гены, отвечающие за устойчивость к вирусу картофеля Y, экономически важному патогену картофеля, устойчивость к солевому стрессу, а также гены, способные предотвратить появление сладковатого вкуса у подмороженного картофеля (cold-induced sweetening of potato) и снизить активность генов, отвечающих за образование акриламида при производстве чипсов). Предполагается разработать рекомендации для использования полученных в ходе выполнения проекта результатов фундаментальных исследований в программах селекции картофеля. Таким образом, в результате выполнения проекта будет создана основа для внедрения новой технологии редактирования генома для создания сортов картофеля с заданным комплексом хозяйственно-ценных признаков, основанной на использовании НЧ как платформы для доставки в клетки растения редактирующего комплекса, отличающейся высокой эффективностью и существенно сниженными побочными эффектами. Кроме того, планируется обсуждение полученных результатов на конференции с участием основных российских компаний и организаций, связанных с исследованиями и селекцией картофеля с целью выработки совместной программы/стратегии внедрения редактирования генома в практику картофелеводства.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Хромов А.В., Гущин В.А., Тимербаев В.И., Калинина Н.О., Тальянский М.Э., Макаров В.В. Guide RNA Design for CRISPR/Cas9 - Mediated Potato Genome Editing Doklady Biochemistry and Biophysics, Vol.479, Issue 1, pp. 90-94 (год публикации - 2018)
10.1134/S1607672918020084

2. Макарова С.С., Хромов А.В., Спеченкова Н.А., Тальянский М.Э., Калинина Н.О. Application of the CRISPR/Cas system for generation of pathogen-resistant plants Biochemistry (Moscow), Vol. 83, Nos. 12-13, pp. 1552-1562 (год публикации - 2018)
10.1134/S0006297918120131

3. Хромов А.В., Макаров В.В., Махотенко А.В., Макарова С.С., Снигирь Е.А., Супрунова Т.П., Калинина Н.О., Тальянский М.Э. Efficient DNAfree nanoparticle mediated genome editing of potato using CRISPR-Cas9 RNP complex FEBS Open Bio, Volume № 8 (Suppl.S1), p.167 (год публикации - 2018)
10.1002/2211-5463.12453

4. Хромов А.В., Махотенко А.В., Снигирь Е.А., Макарова С.С., Макаров В.В., Супрунова Т.П., Калинина Н.О., Тальянский М.Э. Бесплазмидная доставка РНП-комплексов CRISPR/Cas9 в клетки апикальной меристемы растений картофеля Solanum tuberosum Гены & клетки, № 2, стр.88-89 (год публикации - 2018)

5. Махотенко А.В., Хромов А.В., Снигирь Е.А., Макарова С.С., Макаров В.В., Супрунова Т.П., Калинина Н.О., Тальянский М.Э. Функциональный анализ роли коилина в устойчивости растений картофеля Solanum tuberosum к вирусной инфекции и абиотическим стрессам с использованием системы редактирования CRISPR-Cas9 Доклады Академии Наук (год публикации - 2019)

6. Мирошниченко Д.Н., Шульга О.А., Тимербаев В.Р., Долгов С.В. Достижения, проблемы и перспективы получения безтрансгенных растений с отредактированным геномом Биотехнология (год публикации - 2019)

7. Хромов А.В., Махотенко А.В., Снигирь Е.А., Макарова С.С., Макаров В.В., Супрунова Т.П., Мирошниченко Д.Н., Калинина Н.О., Долгов С.В., Тальянский М.Э. Доставка рибонуклеопротеидного комплекса CRISPR/Cas9 в клетки апикальной меристемы для бесплазмидного редактирования генома картофеля Solanum tuberosum Биотехнология (год публикации - 2018)

8. Махотенко А.В., Макаров В.В., Снигирь Е.А., Хромов А.В., Макарова С.С., Калинина Н.О.,Тальянский М.Э. Nanoparticle-mediated delivery of the CRISPR/Cas9 system components into plant cell for genome editing The FEBS Journal, Issue Supplement S1, Volume 284, pp.168 (год публикации - 2017)
10.1111/febs.14174

9. Макарова С.С., Макаров В.В., Тальянский М.Э., Калинина Н.О. Устойчивость картофеля к вирусам: современное состояние и перспективы Вавиловский журнал генетики и селекции, Том 21(1), стр. 62-73 (год публикации - 2017)
10.18699/VJ17.224

10. Хромов А.В., Гущин В.А., Тимербаев В.И., Калинина Н.О., Тальянский М.Э., Макаров В.В. Конструирование гидовых РНК для редактирования генома картофеля с использованием системы CRISPR/Cas9 Доклады академии наук (год публикации - 2017)

11. Хромов А.В., Махотенко А.В., Снигирь Е.А., Макарова С.С., Калинина Н.О., Макаров В.В., Тальянский М.Э. Технология с применением наночастиц для биолистической доставки компонентов системы CRISPR/Cas9 в растения картофеля с целью редактирования генома Acta Naturae, Acta Naturae, спецвыпуск, стр.172. Международная научная конференция по биоорганической химии «XII чтения памяти академика Ю.А. Овчинникова», VIII Российский симпозиум "Белки и пептиды", 18-22 сентября 2017, Москва, Россия (год публикации - 2017)

12. Макарова С.С., Макаров В.В., Тальянский М.Э., Калинина Н.О. Virus resistance in potato: current state and prospects Russian Journal of Genetics: Applied Research, Volume 7, No. 5, pp. 631–643 (год публикации - 2017)
10.1134/S2079059717050148

13. Хромов А.В., Махотенко А.В., Снигирь Е.А., Макарова С.С., Тальянский М.Э., Калинина Н.О., Макаров В.В. Optimization for guide RNA design for effective CRISPR/Cas9 gene editing The FEBS Journal, Issue Supplement S1, Volume 284, pp.169 (год публикации - 2017)
10.1111/febs.14174

14. Макаров В.В., Махотенко А.В., Снигирь Е.А., Хромов А.В., Макарова С.С., Калинина Н.О., Тальянский М.Э. Biolistic delivery of the RGEN RNP into Potato plants for genome editing Book of Abstracts International Science Conferences «2017 in vitro Biology Meeting»,10-14 June 2017 , Raleigh, North Carolina, USA, Book of Abstracts International Science Conferences «2017 in vitro Biology Meeting», P - 3046, 10-14 June 2017 , Raleigh, North Carolina, USA (год публикации - 2017)
10.1007/s11627-017-9835-4

15. Махотенко А.В., Снигирь Е.А., Калинина Н.О., Макаров В.В., Тальянский М.Э. Data on a delivery of biomolecules into Nicothiana benthamiana leaves using different nanoparticles Data in Brief (год публикации - 2017)

16. Макаров В.В., Хромов А.В., Махотенко А.В., Снигирь Е.А., Макарова С.С., Калинина Н.О.,Тальянский М.Э. Biolistic delivery of the CRISPR/Cas9 system components into potato plants Book of Abstracts Vienna International Science Conferences and Events Association «Plant Genome Editing and Genome Engineering», July 3-4, 2017, Vienna, Austria, Book of Abstracts Vienna International Science Conferences and Events Association «Plant Genome Editing and Genome Engineering», July 3-4, 2017, Vienna, Austria (год публикации - 2017)

Публикации