Создание нового типа генетически-кодируемых кальциевых сенсоров для совместной ex vivo визуализации кальциевой и геномной активности в нервной системе.

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 16-15-10323

НазваниеСоздание нового типа генетически-кодируемых кальциевых сенсоров для совместной ex vivo визуализации кальциевой и геномной активности в нервной системе.

Руководитель Субач Федор Васильевич, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)" , г Москва

Конкурс №13 - Конкурс 2016 года на получение грантов по приоритетному направлению деятельности РНФ «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-106 - Нейробиология

Ключевые слова генетически-кодируемый флуоресцентный белок, циркулярно-пермутированный флуоресцентный белок, кальциевый сенсор, редокс-сенсор, флуоресцентная микроскопия, нейронная сеть, нейрональная активность, мозг, немедленный ранний ген cfos, пластичность и память

Код ГРНТИ34.15.29

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Настоящий проект направлен на разработку оригинального подхода по ex vivo визуализации кальциевой активности в нервной системе путем создания нового вида генетически-кодируемых кальциевых сенсоров – медленных кальциевых сенсоров и применение этого нового подхода к фундаментальной нерешенной задаче нейробиологии - совмещению визуализации кальциевой и геномной активности в одних и тех же нейронах мозга в связи с протекающими в них процессами нейрональной пластичности. Известно, что формирование долговременных перестроек в клетках нервной системы как в норме, так и при патологии, сопровождается изменением как их кальциевой активности, так и экспрессии генов. Однако задача по соотнесению этих изменений на уровне индивидуальных нейронов головного мозга остается нерешенной. Мы предлагаем подход, позволяющий впервые решить эту фундаментальную научную задачу путем совмещенной ex vivo визуализации кальциевой и геномной активности нейронов, в моделях различных форм физиологической стимуляции и активации коры головного мозга мыши при ассоциативном обучении. Сегодня решение подобной задачи затруднено из-за ограничений по одновременной визуализации кальциевой и геномной активности в одних и тех же нейронах мозга. Геномный ответ нервных клеток на обучение развивается достаточно медленно, в течение минут, а в определенных фазах и десятков минут. Имеющиеся же в настоящее время кальциевые сенсоры имеют быструю кинетику диссоциации от ионов кальция и в течение 1-3 секунд кальций полностью диссоциирует, и поэтому нет эффективной возможности зафиксировать кальциевую активность нейронов ex vivo даже сразу после нанесенного экспериментального воздействия. Единственный из существующих в настоящее время кальциевый сенсор-интегратор CaMPARI позволяет осуществлять такую ex vivo визуализацию кальциевой активности, но требует для этого постоянного локального in vivo облучения нейронов токсичным светом 405 nm, что ограничивает его применение экспериментальными моделями на небольших беспозвоночных, прозрачной нервной системой эмбрионов или обонятельной луковицей и верхними слоями (2/3 слой) неокортекса млекопитающих с вживленными в череп прозрачными окнами. Для устранения этих ограничений, мы предлагаем оригинальный подход, основанный на создании нового класса медленных кальциевых сенсоров и разработке на их основе подхода по ex vivo визуализации кальциевой активности в мозге млекопитающих. Особенностью нового поколения кальциевых сенсоров будет являться медленная кинетика диссоциации от ионов кальция и после эпизода кальциевой активности сенсор будет находиться во флуоресцентном кальций-связанном состоянии по крайней мере в течении 5-20 минут. Этого времени будет достаточно для фиксации и дальнейшей ex vivo визуализации клеточного распределения кальциевой активности в нервной системе. В отличие от подходов с существующими кальциевыми сенсорами, подход по ex vivo регистрации нейрональной активности с новыми медленными кальциевыми сенсорами даст следующие преимущества: 1) Возникает возможность визуализации кальциевой активности в любой, в том числе глубокой структуре мозга, например, в миндалине, а также одновременно в нескольких структурах, например, в коре, гиппокампе и миндалине; 2) Метод подходит для любых типов сенсорных, физиологических и фармакологических воздействий и поведенческих экспериментов на свободно подвижном животном, без каких-либо ограничений, связанных с осуществлением процедуры засветки требуемого локального участка мозга; 3) Так как нет необходимости устанавливать в черепе оптические окна или имплантировать оптоволоконные зонды, то сокращаются трудозатраты, необходимые при этих операциях; 4) Нет влияния от повреждений мозга, при засветке и визуализации глубоких структур мозга; 5) Имеется возможность совмещения кальциевой активности с другими индикаторами и молекулярными маркерами клеток с помощью метода имммуногистохимического окрашивания. Совмещение визуализации кальциевой сигнализации и геномных реакций нейронов в поведенческих экспериментах с обучением у млекопитающих – комплексный проект, реализация которого будет достигаться за счет объединения экспертизы молекулярно-биологической группы по разработке генетически-кодируемых флуоресцентных сенсоров и белков с одной стороны, и нейробиологической группы по нейробиологическим исследованиям клеточных механизмов ассоциативной памяти и опыт-зависимой экспрессии генов с другой. В рамках работы над проектом: 1) Будет разработан метод по ex vivo визуализации кальциевой активности в мозге мыши. Для этого: 1.1) Будет осуществлена разработка и оптимизация нового класса генетически-кодируемых белковых GFP-подобных кальциевых сенсоров, имеющих медленную кинетику диссоциации кальция, с помощью подхода по направленной молекулярной эволюции в бактериальной системе. 1.2) Будет проведено тестирование и отработка протокола ex vivo фиксации сенсоров. 1.3) Будет проведена характеризация и отбор оптимизированных вариантов медленных кальциевых сенсоров в животных клетках и нейрональной культуре. 1.3) Также с помощью разработанных сенсоров будет продемонстрирована in vivo и ex vivo визуализация кальциевой активности в разных структурах мозга мыши при различных сенсорных воздействиях. 2) Будет впервые осуществлена совместная визуализации геномной и кальциевой нейрональной активностей с клеточным разрешением в одной из областей мозга мыши при формировании и извлечении ассоциативной памяти. Совместная ex vivo визуализация кальциевой и геномной нейрональной активностей будет проведена с помощью конфокальной флуоресцентной микроскопии в модели классического ассоциативного обучения условно-рефлекторному замиранию на звуковой сигнал у мышей. Кальциевая активность будет детектироваться ex vivo по уровню флуоресценции разработанных медленных кальциевых сенсоров, а геномная активность – по экспрессии EGFP белка в результате активации промотора регулируемого нейронной активностью немедленного раннего гена c-fos у трансгенной репортерной линии мышей. Таким образом, предлагаемый метод по совмещенной ex vivo визуализации кальциевой и геномной нейронной активностей впервые даст возможность для клеточного картирования сдвоенного сигнала - кальциево-геномной активности в мозге модельных животных при самых различных поведенческих воздействиях, сенсорных, физиологических и фармакологических стимуляциях и пластических перестройках как в норме, так и при патологии. Разработанный метод сдвоенной визуализации кальциево-геномной нейронной активности будет пригоден для широкого применения в нейробиологических лабораториях мира.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Барыкина Н.В., Доронин Д.А., Субач О.М., Сотсков В.П., Плюснин В.В., Ивлева О.А., Груздева А.М., Куницына Т.А., Ивашкина О.И., Лазуткин А.А., Малышев А.Ю., Смирнов И.В., Варижук А.М., Позмогова Г.Е., Петкевич К.Д., Анохин К.В., Ениколопов Г., и Субач Ф.В. NTnC-like genetically encoded calcium indicator with a positive and enhanced response and fast kinetics. Scientific Reports (год публикации - 2018)
10.1038/s41598-018-33613-6

2. Ланин A. A. , Чеботарев A.С., Барыкина Н.В., Субач Ф.В. , и Желтиков A.M. The whither of bacteriophytochrome-based near-infrared fluorescent proteins: Insights from two-photon absorption spectroscopy. Journal of Biophotonics (год публикации - 2018)
10.1002/jbio.201800353

3. Груздева А.М., Ивашкина О.И., Субач Ф.В., Анохин К.В. ОПТИЧЕСКИЙ ИМИДЖИНГ НЕЙРОНОВ МОЗГА, УЧАСТВОВАВШИХ В ПОЛУЧЕНИИ НОВОГО ОПЫТА: НОВЫЕ IN VIVO И EX VIVO ПРИМЕНЕНИЯ ГЕНЕТИЧЕСКИ КОДИРУЕМЫХ КАЛЬЦИЕВЫХ СЕНСОРОВ Конференция <<Оптогенетика и оптофармакология>> 11-15 апреля 2018 г. (год публикации - 2018)

4. Оксана M Субач, Татьяна A Куницына, Ольга A Минеева, Александр A Лазуткин, Дмитрий В Безряднов, Наталия В Барыкина, Кирилл Д Пяткевич, Юлия Г Ермакова, Дмитрий С Билан, Всеволод В Белоусов, Константин В Анохин, Григорий Н Ениколопов, Федор В Субач Slowly Reducible Genetically Encoded Green Fluorescent Indicator for In Vivo and Ex Vivo Visualization of Hydrogen Peroxide INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES (год публикации - 2019)
10.3390/ijms20133138

5. Субач OM, Барыкина НВ, Анохин KВ, Пяткевич KД, Субач ФВ. Near-Infrared Genetically Encoded Positive Calcium Indicator Based on GAF-FP Bacterial Phytochrome INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES (год публикации - 2019)
10.3390/ijms20143488

6. Пяткевич, Кирилл Д.; Мурдок, Митчелл Г.; Субач, Федор В. Advances in Engineering and Application of APPLIED SCIENCES-BASEL (год публикации - 2019)
10.3390/app9030562

7. Субач OM, Сотсков ВП, Плюснин ВВ, Груздева AM, Барыкина НВ, Ивашкина ОИ, Анохин KВ, Николаева AЮ, Корженевский ДA, Власкина AВ, Лазаренко ВA, Бойко KM, Ракитина TВ, Варижук AM, Позмогова ГE, Подгорный OВ, Пяткевич КД, Бойден ЭС, Субач ФВ Novel Genetically Encoded Bright Positive Calcium Indicator NCaMP7 Based on the mNeonGreen Fluorescent Protein. INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES (год публикации - 2020)
10.3390/ijms21051644

8. Барыкина НВ, Сотсков ВП, Груздева AM, Ву ЮK, Португес Р, Субач OM, Чефановa EС, Плюснин ВВ, Ивашкина OИ, Анохин KВ, Власкина AВ, Корженевский ДA, Николаева AЮ, Бойко KM, Ракитина TВ, Варижук AM, Позмогова ГE, Субач ФВ FGCaMP7, an Improved Version of Fungi-Based Ratiometric Calcium Indicator for In Vivo Visualization of Neuronal Activity INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES (год публикации - 2020)
10.3390/ijms21083012

9. Оксана M Субач, Федор В Субач GAF-CaMP3-sfGFP, An Enhanced Version of the Near-Infrared Genetically Encoded Positive Phytochrome-Based Calcium Indicator for the Visualization of Neuronal Activity INTERNATIONAL JOURNAL OF MOLECULAR SCIENCES (год публикации - 2020)
10.3390/ijms21186883

10. Халид Саидов, Анна Тиунова, Оксана Субач, Федор Субач, Константин Анохин New Tools in Cognitive Neurobiology: Biotin-Digoxigenin Detection of Overlapping Active Neuronal Populations by Two-Color c-fos Compartment Analysis of Temporal Activity by Fluorescent in situ Hybridization (catFISH) and c-Fos Immunohistochemistry OBM Genetics (год публикации - 2019)
10.21926/obm.genet.1901065

11. Доронин Д. А., Барыкина Н. В., Субач О. М., Сотсков В. П., Плюснин В.В., Ивлева О.А., Исаакова Е. А., Варижук А. М., Позмогова Г. Е., Малышев А. Ю., Смирнов И. В., Пяткевич К. Д., Анохин К. В., Ениколопов Г. Н., и Субач Ф. В. Genetically encoded calcium indicator with NTnC-like design and enhanced fluorescence contrast and kinetics BMC Biotechnology (год публикации - 2017)

12. Барыкина Н.В., Субач О.М., Доронин Д.А., Сотсков В.П., Рощина М.А., Куницына Т.А., Малышев А.Ю., Смирнов И.В., Азиева А.М., Соколов И.С., Пяткевич К.Д., Бурцев М.С., Варижук А.М., Позмогова Г.E., Анохин К.В., Субач Ф.В. и Ениколопов Г.Н. A new design for a green calcium indicator with a smaller size and a reduced number of calcium-binding sites Scientific Reports, v. 6, article number: 34447 (год публикации - 2016)
10.1038/srep34447

13. Барыкина Н.В., Субач О.М., Пяткевич К.Д., Юнг Э., Малышев А.Ю., Смирнов И.В., Богородский А.О., Борщевский В.И., Варижук А.М., Позмогова Г.Е., Бойден Э.С., Анохин К.В., Ениколопов Г.Н., Субач Ф.В. Green fluorescent genetically encoded calcium indicator based on calmodulin/M13-peptide from fungi PLOS ONE (год публикации - 2017)
10.1371/journal.pone.0183757

Публикации